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體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)
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在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下,使培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞暴露于受試樣品中。用中期分裂象阻斷劑(如秋水仙素)處理,使細(xì)胞停止在中期分裂象,隨后收獲細(xì)胞、制片、染色、分析染色體畸變。通過檢測受試樣品誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞染色體畸變的能力,從而評價(jià)受試樣品的致突變性及其強(qiáng)度。中科檢測可以開展體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)。
體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)方法
⒈細(xì)胞培養(yǎng)與染毒。試驗(yàn)需在加入和不加入S9的條件下進(jìn)行。試驗(yàn)前一天,將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿(瓶)中,放C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。試驗(yàn)時(shí)吸去培養(yǎng)皿(瓶)中的培養(yǎng)液,加入一定濃度的受試樣品、S9混合液(不加s9混合液時(shí),需用培養(yǎng)液補(bǔ)足)以及一定量不含血清的培養(yǎng)液,放培養(yǎng)箱中,根據(jù)細(xì)胞周期決定處理2~6小時(shí)。
結(jié)束后,吸去含受試樣品的培養(yǎng)液,用Hanks液洗細(xì)胞3次,加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,放回培養(yǎng)箱,于24小時(shí)內(nèi)收獲細(xì)胞。于收獲前2~4小時(shí),加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑(如用秋水仙素,作用時(shí)間為4小時(shí),終濃度為1ug/ml)。
⒉用0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞,待細(xì)胞脫落后,加入含10%胎牛或小牛血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用,混勻,放入離心管以1000~1200r/min的速度離心5~7分鐘,棄去上清液。
?、臣尤?.075mol/LKCl溶液7ml,用滴管將細(xì)胞輕輕地混勻,放入37℃水浴中低滲處理7分鐘,加入2ml固定液(甲醇:冰醋酸3:1)混勻,以1500r/min速度離心5~7分鐘,棄去上清液。
?、醇尤?ml固定液,混勻后固定7分鐘,以1500r/min速度離心7分鐘,棄去上清液。用同法再固定1~2次,棄去上清液。
?、导尤霐?shù)滴新鮮固定液,混勻。用混懸液滴片,自然干燥。用吉姆薩染液染色。
?、哆x擇100個(gè)分散良好的中期分裂象,在顯微鏡油鏡下進(jìn)行讀片。在讀片時(shí)應(yīng)記錄每一觀察細(xì)胞的染色體數(shù)目,對于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視標(biāo)位置及畸變類型。所有處理組、陽性和陰性對照組均需測定有絲分裂指數(shù)。每一劑量組應(yīng)分析不少于500個(gè)分散良好的中期分裂象。
體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)
《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)第六章9體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)
《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)第六章11哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)
消毒劑安全性毒理學(xué)評價(jià)程序和方法GB/T38496-2020(6.8.3)
消毒技術(shù)規(guī)范(衛(wèi)生部2002年版)(2.3.8.3)
消毒劑安全性毒理學(xué)評價(jià)程序和方法GB/T38496-2020(6.8.5)
消毒技術(shù)規(guī)范(衛(wèi)生部2002年版)(2.3.8.5)
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)GB15193.6-2014
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